A microscopia de contraste de fase (PCM) é uma técnica de microscopia óptica que converte mudanças de fase na luz que passa por uma amostra transparente para alterações de brilho na imagem. As mudanças de fase são invisíveis, mas tornam -se visíveis quando mostradas como variações de brilho.
Quando as ondas de luz viajam por um meio que não um vácuo, a interação com o meio faz com que a amplitude e a fase da onda mudem de maneira dependente das propriedades do meio. Alterações na amplitude (brilho) surgem da dispersão e absorção da luz, que geralmente depende do comprimento de onda e pode dar origem às cores. O equipamento fotográfico e o olho humano são sensíveis a variações de amplitude. Sem acordos especiais, as mudanças de fase são, portanto, invisíveis. No entanto, as mudanças de fase geralmente transmitem informações importantes.
O princípio básico para tornar as alterações de fase visíveis na microscopia de contraste de fase é separar a luz iluminadora (em segundo plano) da luz espalhada por espécime (que compõe os detalhes do primeiro plano) e manipulá-los de maneira diferente.
A luz iluminadora em forma de anel (representada em verde na figura) que passa o anel do condensador está focada no espécime pelo condensador. Parte da luz iluminadora é espalhada pelo espécime (amarelo). A luz restante não é afetada pela amostra e forma a luz de fundo (vermelha). Ao observar uma amostra biológica não corada, a luz dispersa é fraca e tipicamente muda de fase em -90 graus (devido à espessura típica das amostras e à diferença de índice de refração entre o tecido biológico e o meio circundante) em relação à luz de fundo. Isso leva ao primeiro plano (vetor azul na figura acompanhante) e fundo (vetor vermelho) com quase a mesma intensidade, resultando em baixo contraste de imagem.
Em um microscópio de contraste de fase, o contraste da imagem é aumentado de duas maneiras: gerando interferência construtiva entre raios de luz dispersos e de fundo em regiões do campo de visão que contêm a amostra e reduzindo a quantidade de luz de fundo que atinge o plano da imagem. [4] Primeiro, a luz de fundo é deslocada em fase em -90 graus, passando por um anel de mudança de fase, que elimina a diferença de fase entre o fundo e os raios de luz espalhados.
Quando a luz é focada no plano da imagem (onde uma câmera ou ocular é colocada), essa mudança de fase causa fundo e raios de luz espalhados originários de regiões do campo de visão que contêm a amostra (ou seja, o primeiro plano) para interferir construtivamente, resultando em um aumento no brilho dessas áreas comparado às regiões que não contêm a amostra. Finalmente, o plano de fundo está diminuído ~ 70-90% por um anel de filtro cinza; Este método maximiza a quantidade de luz dispersa gerada pela luz de iluminação, enquanto minimiza a quantidade de luz de iluminação que atinge o plano da imagem. Algumas das luzes dispersas que iluminam toda a superfície do filtro serão mudadas de fase e diminuídas pelos anéis, mas em uma extensão muito menor que a luz de fundo, que apenas ilumina os anéis de filtro de fase e cinza.
O acima descreve o contraste da fase negativa. Em sua forma positiva, a luz de fundo é deslocada em fase pelo grau +90. A luz de fundo estará, portanto, de 180 graus fora de fase em relação à luz dispersa. A luz dispersa será então subtraída da luz de fundo para formar uma imagem com um primeiro plano mais escuro e um fundo mais claro.
